Теория и практика стерилизации

Обработка, в результате которой объект становится свободным от каких-либо живых организмов, называется стерилизацией. Стерилизацию можно производить с помощью губительно действующих (летальных) физических или химических агентов, а растворы можно стерилизовать фильтрованием.
Чтобы были понятны принципы стерилизации при помощи летальных воздействий, необходимо вкратце описать кинетику гибели микробной популяции. В случае микроорганизма единственным обоснованным критерием его гибели служит необратимая утрата способности к размножению. Обычно ее оценивают количественно путем высева на чашки с последующим подсчетом выживших организмов (образованных ими колоний). Если действию летального агента подвергается чистая культура микроорганизма, то почти всегда кинетика гибели оказывается экспоненциальной: количество выживших организмов уменьшается со временем обработки в геометрической прогрессии. Это отражает тот факт, что все члены популяции обладают одинаковой чувствительностью, так что момент гибели каждого данного организма определяется лишь случайностью. Если откладывать логарифм числа выживших организмов как функцию времени воздействия, получится прямая. Наклон этой прямой, взятый с обратным знаком, определяет скорость гибели.
Скорость гибели говорит лишь о том, какая доля исходной популяции переживет обработку определенной длительности. Чтобы определить, сколько организмов может выжить в действительности, нужно знать также величину исходной популяции. Таким образом, при проведении стерилизации нужно учитывать два фактора: скорость гибели и размер исходной популяции.

На практике популяции, подлежащие уничтожению, почти всегда бывают смешанными . Так как микроорганизмы сильно различаются по устойчивости к действию летальных агентов, существенными факторами оказываются размер исходной популяции и скорость гибели наиболее устойчивых ее членов. В смешанной популяции почти всегда наиболее устойчивы эндоспоры некоторых бактерий. Поэтому для того, чтобы проверить эффективность методов стерилизации, обычно используют суспензию спор, устойчивость которых известна.

Если учесть кинетику гибели микробов, то можно сформулировать практическую цель стерилизации с помощью летального агента несколько точнее: вероятность того, что стерилизуемый объект после обработки будет содержать хотя бы один выживший организм, должна быть ничтожно малой. Например, если мы хотим про-стерилизовать 1 л культуральной среды, то для любых практических целей достаточно, если после обработки выживет не более одного организма на 10б л среды. Вероятность неудачного исхода в этом случае поистине чрезвычайно мала. Методы стерилизации подбирают таким образом, чтобы всегда обеспечить очень большой запас надежности.

Виды стерилизации и их методы

Тепловая стерилизация

Наиболее широко для стерилизации используют тепловую обработку. Предметы можно стерилизовать сухим жаром, прогревая их в печи в атмосфере воздуха, или влажным жаром (т. е. при помощи пара). При стерилизации сухим жаром требуется прогрев гораздо более длительный и до более высоких температур, чем при использовании влажного жара, так как воздух обладает гораздо меньшей теплопроводностью , чем пар. Кроме того, бактерии могут полностью высыхать, а в высушенном состоянии термо-устойчивость вегетативных клеток бактерий значительно возрастает и почти достигает уровня, характерного для спор. В результате скорость гибели высохших клеток оказывается сильно сниженной.
Сухой жар используют в основном для стерилизации стеклянной посуды и других термоустойчивых твердых материалов. Предметы заворачивают в бумагу или иным способом защищают от последующего загрязнения и выдерживают в печи при температуре 170 °С в течение 90 мин.
Для тепловой стерилизации водных растворов следует использовать пар. Обработку проводят обычно в автоклаве — специальном металлическом сосуде, который может заполняться паром под давлением выше атмосферного. В результате стерилизацию можно проводить при температурах, значительно превышающих температуру кипения воды при нормальном давлении. Обычно используемые в лабораториях автоклавы работают при давлении пара, превышающем атмосферное давление примерно на 1 кг/см2, что соответствует температуре 120 °С. При такой температуре быстро погибают даже бактериальные споры, которые выдерживают кипячение в течение нескольких часов. Небольшие объемы жидкости (примерно до 3 л) можно простерилизовать таким способом за 20 мин. Для стерилизации больших объемов требуется соответственно более длительная обработка.
Температура 120 °С внутри автоклава будет достигнута при избыточном давлении 1 кг/см2 только в том случае, если атмосфера в автоклаве состоит исключительно из пара. Поэтому сначала удаляют из камеры весь находящийся там воздух, вытесняя его паром. Для этого используют паровой клапан, который оставляют открытым, пока через него выходит воздух, и закрывают, как только автоклав заполнится паром. Если в камере автоклава останется воздух, то парциальное давление пара в ней будет ниже того, которое показывает манометр. Соответственно ниже будет и температура в автоклаве. Поэтому автоклавы всегда снабжают как термометром, так и манометром. Температуру внутри стерилизационной камеры можно также контролировать, помещая в нее вместе со стерилизуемыми предметами специальные индикаторные бумажки, которые изменяют цвет, если прогрев был достаточным.

Химическая стерилизация

Многие вещества, вводимые в состав культуральных сред, слишком термолабильны, и их нельзя стерилизовать в автоклаве. Для работы с такими веществами крайне полезен был бы надежный метод химической стерилизации. Существенное требование, которому должен удовлетворять химический стерилизующий агент, заключается в том, что он должен быть не только токсичен, но еще и летуч: нужно , чтобы он быстро исчезал из простерилизовашюго объекта. Наилучшим из доступных веществ такого типа является окись этилена. Это жидкость, кипящая при 10,7 °С. При температуре от 0 до 4°С окись этилена можно добавлять в растворы в жидком виде (до конечной концентрации примерно 0,5—1,0%), а при температуре выше точки кипения использовать в виде стерилизующего газа. Однако окись этилена химически нестойка и распадается в водных растворах, образуя этиленглюколь, который уже не летуч и может вызывать нежелательные эффекты. Кроме того, она взрывоопасна и токсична для человека, так что при ее использовании необходимо принимать специальные меры предосторожности.

Стерилизация фильтрованием

Для стерилизации растворов термолабильных веществ в лабораториях обычно пропускают их через фильтры, способные задерживать микроорганизмы. Такие фильтры почти всегда обладают комплексным действием. Частично микроорганизмы задерживаются ими потому, что поры фильтра достаточно узки, а частично из-за адсорбции на стенках пор. Адсорбция имеет большое значение, так как фильтр может эффективно задерживать даже такие микроорганизмы, средние размеры которых несколько меньше среднего диаметра пор. Метод стерилизации путем фильтрования имеет один существенный недостаток: так как нижний предел величины вирусных частиц близок к размерам крупных белковых молекул, вирусы вовсе не обязательно задерживаются такими фильтрами, которые не пропускают даже мельчайшие клетки микроорганизмов. Поэтому никогда нельзя быть уверенным, что фильтрование, освобождающее раствор от бактерий, очистит его также и от вирусов.